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多肽药物中相关结构杂质分析

浏览数量:25     作者:本站编辑     发布时间: 2021-03-02      来源:本站

多肽是氨基酸脱水缩合的反应产物。根据美国药典定义,氨基酸数量在 40 以下的缩合产物称为多肽;氨基酸数量大于 40 的缩合产物则需要考虑其空间结构,称为蛋白质。多肽易于人工合成和序列优化,可很快确定其药用价值。由于本身的特性,多肽从临床试验到获得美国食品药物监督管理局批准所需的时间比小分子药物短很多,而多肽药物通过临床试验的机率比小分子化合物要高两倍,与小分子化合物相比,多肽的半衰期一般较短,在体内容易被快速代谢;相对大分子蛋白或抗体类药物,多肽更稳定用量更少、单位活性也更高;与大分子蛋白相比,多肽化学合成技术成熟,易与杂质分离,纯度更高。多肽比蛋白抗体类药物成本低,但比很多小分子药物的成本高,随着科技的进步,设备更新和工艺改善,多肽的合成成本和商业成本已经大幅度下降。这些优点使多肽在药物开发中具有特定的优势。


多肽的化学合成最初始于液相合成,但由于多肽液相合成的每一步都要进行纯化和分离,操作繁琐。1963 年美国化学家 Merrifield 报道了用固相树脂作为载体合成四肽化合物(Leu-Ala-Gly-Val)的方法,标志着多肽固相合成时代的开始,推动了多肽固相合成的规模化生产。如今,多肽固相合成法已被广泛应用。在多肽合成和储存过程,容易形成相关结构杂质,如氨基酸丢失、氨基酸插入、去氨基化、降解产物等。很多相关结构杂质不但没有药物疗效,反而具有一定的毒副作用。因此,欧盟药典规定需对含量在 0.5%以上的相关结构杂质进行定性分析,对含量在 1%以上的相关结构杂质进行定量分析并考察其毒副作用。


多肽固相合成:Solid phase synthesis of peptides

目前,大多数多肽药物是通过固相合成技术来获得。固相合成以连接在固相载体的首个氨基酸为起点,经脱保护基、活化、缩合耦连的循环过程,将氨基酸逐一连接直到获得目标序列多肽。主要步骤如图 1:a,将氨基保护的第一个氨基酸通过酯键固定到树脂上。b,脱保护基。c,将氨基保护的第二个氨基酸的羧基与固定在树脂上的第一个氨基酸的氨基进行脱水缩合,通过肽键将氨基酸逐个连接。d,将多肽从树脂上洗脱,并脱侧链保护基。

杂质类别( the Categories of impurities)

多肽药物在合成和储存过程,容易形成相关结构杂质,如氨基酸丢失、氨基酸插入、保护基残留、氧化/还原、侧链修饰、末端修饰、聚集体等。

氨基酸缺失(Amino acid deletion)

在多肽固相合成中,连接在树脂上的氨基酸保护基的不完全脱除或引入了未完全活化的氨基酸都会降低缩合反应效率,这将导致整个肽链缺失一个或多个氨基酸残基。在运输和储存过程中,也会产生少量降解产物,在 N 或 C 端缺失一个或多个氨基酸残基,也可归为氨基酸缺失的杂质。

氨基酸插入(amino acid insertion)

在多肽固相合成中,为确保最大缩合效率,往往加入过量的氨基保护的氨基酸。然而,如果缩合反应结束后,过量的反应物没有被完全冲走,就会造成额外的氨基酸插入到目标肽序列中。

氧化/ 还原(oxidation/reduction)

在多肽固相合成中,某些氨基酸残基易于发生氧化/还原反应。在卡比托辛和依来多辛粗产品中分别发现了半胱氨酸和蛋氨酸被氧化生成的杂质。相对于目标多肽,这些杂质的分子量增加了 16、32 和 48,根据氧化程度,分别为亚砜、砜、磺酸。

侧链修饰杂质(Side chain modifies impurities)

天冬酰胺和谷氨酰胺等两种碱性氨基酸侧链含有氨基,在多肽合成和储存过程中,易失去氨基、增加羟基,从而形成去氨基化的产物,由于-CONH 2 转换为-COOH,去氨基化产物的分子量增加

末端修饰杂质(End-modified impurity)

N 端为谷氨酰氨的多肽在储存过程中,当温度高于 4˚C 时,易脱水发生焦谷氨酰化。

聚集体(aggregation)

多肽聚集可分为共价和非共价两种,其形成的程度取决于各种环境因素。共价聚集体通常由两个单体通过酰胺键、二硫键形成。非共价聚集体是疏水作用、静电作用等弱相互作用的结果。通常非共价聚集体与其单体之间存在平衡转换。这种平衡受样品浓度和溶剂性质(如 pH)影响


在多肽药物的合成、储存及运输过程中,会产生多种类型的相关结构杂质。存在于多肽药物中的相关结构杂质会影响其生物功能及药效。因此,在药物研发阶段和临床使用过程中,相关结构杂质分析及控制是需要考虑的重要因素之一。现有的文献报道,多肽药物中杂质分析通常利用分子量的变化推测可能的氨基酸序列及修饰,而对氨基酸插入、去氨基化等修饰位点的研究较少。因此,开发对多肽药物中杂质序列及修饰的准确分析方法至关重要,串联质谱技术及高分辨质谱技术的发展将在多肽药物中杂质分析领域发挥重要作用。


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