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多肽杂质控制

多肽类药物的发展越来越受到医药界的关注,其具有毒副作用低、用量少、生物活性强、疗效好、无代谢异化等特点。全球已上市的合成多肽类药物有六十多种,较为成熟的品种已经收载于各国药典中,其中的合成多肽原料药有21种,制剂有25种,还有500-600个进入临床研究的多肽类药物。药品质量控制的关键之一是进行药物杂质的控制,

什么是多肽类药物杂质
多肽类药物是介于传统的化学药物和大分子药物之间的一种特殊药物,其结构特征,合成方法,剂型都有自身的特殊性,因此对这类药物的杂质控制和研究,面临新的挑战。

多肽类药物合成主要有液相合成和固相合成两种方法,固相合成采用固相载体,由去保护-激活和交联-洗脱和脱保护三个循环组成,固相合成又可分为Boc法和Fmoc法,此种合成方法越来越成熟,并逐渐占据了多肽合成的主导地位,主要特点是易于实现自动化,适于合成中、长肽,但是也有中间体不能纯化,粗品产物纯度不如液相合成的缺点。液相合成又可分为逐步合成和片段合成法,适于合成短肽,每步产物都可纯化,可以得到高纯度的产品,但是自动化程度较低。在传统的液相固相合成多肽方法的基础上,又发展了氨基酸的酸内酸酐(NCA)法,液相分段合成法和组合化学法。

多肽类药物由不同种氨基酸按照一定的顺序组合而成,根据此类药物的工艺特点,需要经过的合成步骤比较多,由此产生的杂质较为复杂。合成多肽的有关物质主要为:合成过程中带入的工艺杂质如缺失肽,断裂肽,氧化肽等肽类相关物质;由于多肽脱酰胺,氧化,水解,二硫键错配,消旋等不稳定因素而产生的
降解产物及聚合物。多肽类药物制剂主要是注射液和注射用粉针,在生产和储存过程中更易发生降解变化,产生降解杂质。合成多肽中由于杂质众多,成分较为复杂,性质各不相同,有的与多肽药物很相似,有的差别较大,且此类杂质在较低浓度下便可能产生较大的毒性,并且据有关研究报道,多肽中即使只有一两个氨基酸次序发生变化,就可能将激动剂变为拮抗剂,产生相反的作用,由于药物的安全性不仅仅是主要活性成分的毒性而且是杂质的毒性,所以建立适宜的方法检出这些杂质进行有关物质分析,是进行多肽类药物质量控制的关键。欧洲药典7.0附录“Substancesforpharmaceuticaluse”中已对多肽类药物的有关物质限度进行限定,分别制定报告限度(0.1%),鉴定限度(0.5%)和质控限度(1.0%)分别为。由此可见,应该重视此类药物有关物质的研究和控制。

多肽类药物有关物质的检测方法
1.反相高效液相色谱法

高效液相色谱法已经成为药物质量分析中最常用的方法,具有灵敏,准确,快速的特点,多肽类物质是由多个氨基酸通过肽键连接而成,有一定的疏水性,在C18柱上有一定的保留,在反相高效液相色谱中能有效分离,现在多肽类药物的有关物质分析大多采用高效液相色谱法。由于合成多肽类药物中可能含有的有关物质较为复杂,多采用梯度洗脱的方法,极个别的采用等度洗脱,如EP7.0中醋酸戈那瑞林,USP34中去氨加压素,亮丙瑞林等。对现行各药典中合成多肽类药物有关物质分析方法做了汇总分析。各药典对共同收载的多肽类药物有关物质的分析方法,大多数一致,但也存在不一致的品种,如醋酸戈那瑞林,去氨加压素在USP34与EP7.0采用不同的流动相体系,究竟哪种流动相体系更适于该种药物的分析,还需进一步探究。

2毛细管电泳
除采用传统的高效液相色谱法进行有关物质分析外,毛细管电泳用于多肽类药物的分析也具有较大的优势,毛细管电泳兼具有高压电泳及高效液相色谱法的优点,与高效液相色谱法的疏水性的分离机制不同,存在多种分离模式,具有分析速度快,分辨率高,样品用量少,操作简便,消耗少等特点。毛细管电泳在各国药典中的应用也越来越多,USP、BP、Chp均收录了毛细管电泳法,并详细介绍其定义,分类,基本原理,仪器构造及操作参数等,并且在USP,BP中,已经有多个药物品种的质量标准中使用了毛细管电泳,UlrikeHolzgrabe综述了毛细管电泳在EP,JP,USP中的应用,其在杂质分析特别是在多肽蛋白类药物杂质分析中,具有很大的优势,目前多肽类药物的质量控制中采用毛细管电泳作为检测方法的还比较少。欧洲药典7.0中,谷胱甘肽的有关物质测定采用毛细管电泳法。Ridge等报道了用毛细管电泳和高效液相色谱法对缓激肽的纯度进行分析,用磷酸调节pH在不同条件下分离出不同的杂质,而采用HPLC法显示只有一个缓激肽主峰。Catai等采用双涂层毛细管柱分析重组人生长激素(hGH)的纯度,将hGH与其脱氨产物剪切产物18位氨基酸Gln突变产物有效分离。未来随着毛细管电泳方法本身的不断完善以及仪器的发展,克服自身重现性和精密度不高的缺点,毛细管电泳(CE)逐渐成为多肽类药物分析的有力工具。

3高效液相色谱质谱联用
液质联用技术目前已经成为分离鉴定各种化合物的重要手段,MS是强有力的结构解析工具,能为结构定性提供较多的信息,作为理想的色谱检测器,不仅特异性强,而且具有极高的检测灵敏度。自从“软电离”技术的出现为分析强极性,难挥发,不稳定生物大分子提供了可能,生物质谱随之发展起来,现在HPLC-ESI-MS/MS广泛应用于多肽蛋白等生物大分子的分离分析中,用于进行分子量测定和结构分析。采用液质联用进行多肽类药物有关物质分析时,可以在不得到纯杂质的情况下,给出杂质的一级甚至多级质谱信息,从而获得该杂质的分子量及序列信息,为相关肽定性和结构解析提供依据。

合成多肽类药物属于特殊的化学药物,目前对其有关物质的控制常采用峰面积归一化法或自身对照法,这难免会因为响应因子差别较大引起定量不准,今后将建立以杂质对照品进行定性定量分析的有效杂质控制手段。对于有些合成多肽类药物,其中杂质含量偏高,在活性或安全性并不明确时,应该进行深入的研究,
使杂质水平控制在合理的范围内。


 

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